Методът за особено прецизно определяне на масата на молекулите и идентифициране и количествено определяне на веществата в биологични проби в медицината е масспектрометрията. Къде и как се прилага, и защо, на тези въпроси отговаря проф. д-р Добрин Свинаров.
Визитка♦ Проф. д-р Добрин Свинаров, д.м.н. е академик от БАНИ. Началник е на Централната клинична лаборатория към УМБАЛ „Александровска“, МФ, МУ-София. Има три специалности - клинична лаборатория, фармакология, клинична фармакология и терапия. Бил е национален консултант, член на Комисията по позитивен лекарствен списък към МЗ и на Групата за научни съвети към Европейската лекарствена агенция. Член и ръководител на научни проекти финансирани от МОН, МУ, Фондация Фолксваген и индустрията. Носител на всички най-престижни награди на МУ-София, автор на повече от 350 труда - монографии, глави от книги и учебници, научни статии, рационализации, изобретения и патенти. Носител е на национални и международни отличия. |
- Проф. Свинаров, да погледнем науката зад кулисите на диагнозата. Как ще обясните на достъпен език какво е масспектрометрията - „златен стандарт“ днес?
- Това е едно от основните направления на технологичния трансфер изобщо в медицината и не е от вчера в арсенала ни. Само в нашата лаборатория имаме повече от 20 г. опит, а в световен мащаб тя се използва от 60-70-те години на миналия век. Разбира се, не във всяка медицинска лаборатория и предимно за високо специализирани изследвания.
С нея е възможно да се постигне това, което не е достъпно за другите аналитични технологии в лабораторната медицина, защото е най-чувствителният, селективен и специфичен метод за анализ на известни и неизвестни съединения. Тя може да разгадае по спектъра на молекулата ново и непознато вещество. Може да счупи фемто- и атто-моловата бариера за концентрация. Това означава 10 на степен -18, -21, като концентрация, което е недостижимо за другия аналитичен арсенал, с който разполагаме в медицинската лаборатория.
- На какво се дължи нейната висока чувствителност и специфичност?
- Това е технология, която, първо, се извършва във вакуум, а вакуумът е много съществено предусловие за висока чувствителна специфичност. Мога да го сравня, например, с магистрала „Тракия”, която беше задръстена от Вакарел до Ихтиман при излизането от София, с колосални опашки. Дори и човек да разполага с червено ферари, с часове се забавя движението му. Ако магистралата е празна, разстоянието ще се измине за минути. Това е предназначението на вакуума. Няма придружаващи, пречещи молекули и вещества за това, което влиза в апарата за анализ. По този начин се осигурява високата селективност и чувствителност на анализа.
Второ, с всяка молекула се извършват няколко реакции. Първо, тя се превръща от неутрално съединение в йон, второ – този йон се филтрира и пречиства, трето – пречистеният йон се фрагментира и по букета продукти и фрагменти, които се получават от него, можем да съдим за структурата и да измерим концентрацията на молекулата. Теоретично и практически, масспектрометрията в момента, не само в медицината, но в аналитичната химия изобщо, все още е най-добрият метод за идентификация и за количествен анализ във всичките му измерения.
- Защо е един от методите, който трасира технологичния трансфер в медицината?
- С нея е възможно молекулно изобразяване на тъканта в патологията, без да се нарушава архитектониката, структурата на тъканта. Представяте ли си каква е разликата между това да оцветиш с определен разтвор и да проявиш един или друг ензим или друга клетъчна структура и едновременно и алтернативно на това да можеш да изобразиш десетки, стотици, хиляди молекули вътреклетъчно, във всяка клетка на хистологичния препарат, без да нарушиш структурата му?
Това се нарича изобразяване с массспектрометрия и е утрешният ден, в който информацията за промените на тъканно равнище ще бъде изключително много по-задълбочена, с повече диагностични възможности и оттам – със създаване на нови прицелни точки за ефективна терапия, насочена към съответни деликатни промени в молекулната структура, в хистологията и в клетката.
Тя присъства и в операционните зали защото е възможно скалпелът, с който се извършва разрезът и операцията, да бъде йонизатор и в момента на разрязването да дава информация за молекулната структура на тъканта, а на екрана пред очите на хирурга се изобразява спектър на молекулите, които попадат в разреза. И този спектър свети в червено, ако става дума за злокачествена тъкан, или в зелено – за доброкачествена тъкан. Представяте ли си какво означава това? Молекулно да се води ръката или ножа на хирурга, за да отстрани напълно злокачествената, лошата тъкан и да се запази максимално здравата.
Представете си какво приложение има това във всяка област на хирургическата практика, особено в неврохирургията. И това не е фантастика, прави се експериментално от над 20 години. Хиляди пациенти са оперирани по този начин и аз предполагам, че в недалечно време хирургическият йонизаторен нож ще влезе в медицинската практика. И е много интересно как ще реагират колегите хирурзи, когато се окаже, че технология ще води ръката им в извършването на операцията. Така или иначе, това е потенциалът на масспектрометрията в хирургията.
- Защо в медицината възниква необходимостта да се прилага стероидно профилиране, а масспектрометрията замества имунохимичните методи за анализ?
- Нека да кажем, че стероидите са две категории. Надбъбречните, заедно с мъжките и женските полови хормони са в една обща категория. В другата категория са стероидите от групата на витамин D. Занимаващите се по-задълбочено с биохимичните и патобиохимичните особености на витамин D обмяната, познаваме едно, две или три такива съединения, но в нашия организъм, само от групата на витамин Д циркулират повече от 50 засега известни стероида.
Само кожната реакция за превръщането на холестерола, по-точно 7-хидрохолестерола в холекалциферол (витамин Д3), минава през 15-20 междинни съединения, всички те циркулират в кръвта. Имунохимичните методи изследват от порядъка на 7-8 до 10 хормона – няколко надбъбречни, мъжките и женските полови хормони.
Едновременно с това циркулират още 300 стероида от групата
Някои от прекурсорите (предшественици на активните вещества) и част от екскреторните им продукти са с пъти, понякога с хиляди пъти по-високи в концентрации. Когато умножим 1000 по 0.1, ще видим какъв е рискът за интерференция, тоест, за пречене и за неверен резултат при изследване с имунохимичен метод. Типичен пример в тази връзка е изследването на тестостерон при жени и деца, както и при хипогонадни мъже, когато е в много ниски концентрации.
Всички имунохимични методи, независимо от декларацията, фалират над горната граница на определяне при деца и жени – от порядъка на 4 наномола на литър. Резултатът под тази стойност може да бъде в диапазона плюс-минус 100%. Американците наричат този тип анализи на тестостерон с имунохимични методи Educated guess –образована догадка, а не количествен анализ.
- Откога датира този тип изследване?
- В ендокринологията - много отдавна, защото гарантира именно такава селективност, специфичност и чувствителност, каквато е недостижима за имунохимичните методи. Второ специално приложение на масспектрометрията в анализа на стероиди е в групата на т. нар. непокрити медицински нужди. Например, при мъже и жени, когато се налага лечение с потискане на продукцията на полови хормони. При рака на млечните жлези и на простатата се налага понякога т. нар. химическа кастрация с лекарства, които пречат да се образуват тези хормони, когато са туморогенни и предизвикат напредъка на болестния процес. Контролът на терапията изисква да докажем, че се поддържат ниски концентрации от тези хормони, по-специално, на естрадиола и тестостерона при това лечение.
Имунохимичните методи имат граница на количествен анализ - най-ниска надеждно определена концентрация. Но на нас ни трябва с надеждност да кажем дали е 1, 2 или 5, и в тези случаи нямаме алтернатива – трябва да се приложат масспектрометрични методи за изследване. В световен мащаб ендокринологичното общество много отдавна е взело решение, първо, когато се представят сериозни научни резултати, те да бъдат базирани на масспектрометрия. Дори в клиничната практика се изисква да се изследват стероидните хормони с масспектрометрия, именно поради причините, които изброих - несигурността, пречките, получаването на ненадеждни и фалшиво високи резултати.
- Защо задължително трябва да се прави стероидно профилиране?
- Със стероидното профилиране можем да преценим цялата ос от предшествениците, през активния хормон и екскреторния продукт. Техните взаимоотношения дават изключително полезна и много по-задълбочена информация за фините отклонения в метаболизма, които могат да бъдат в основата на вродени или придобити заболявания. Единичното изследване на активния хормон, само с имунохимични методики, не може да представи такава информация. Това е ролята на стеоридното профилиране, и затова ние сме го въвели от 7-8 години, но в условията на „пътечната“ медицина този много важен анализ не може да се наложи рутинно.
- Къде още се прилага стероидното профилиране с масспектрометрия?
- У нас се провежда масов скрининг за вроден дефект на работата на надбъбречните жлези, които произвеждат стероидни хормони. Изследването се извършва с имунохимичен метод за един стероиден прекурсор – 17-хидрокси прогестерон. Годишно се откриват около 2-3 000 случая с повишен 17-хидрокси прогестерон и повечето от тях са фалшиво положителни. Затова, преди поставяне на диагнозата вродена надбъбречна хиперплазия, е необходимо потвърждение с масспектрометрия. И от 2-3 000 истински болни излизат 20-30.
Какво напрежение, психически стрес и ненужни диагностични и, евентуално – терапевтични процедури са при фалшивото установяване на такова състояние при дете! Ние адаптирахме при стероидното профилиране вариант, при който от суха капка кръв се изследват едновременно онези 8 хормона, които след получаване на положителен резултат от скрининга, дават информация има или няма вродена надбъбречна хиперплазия. Това беше през 2017-2018, но все още няма национално решение, потвърдителният масспектрометричен метод да се включи в програмата за доказване на тези състояния.
- Да очакваме ли в близко бъдеще всеки пациент да има свой биохимичен паспорт, който да насочва лечението му индивидуално?
- Технологично това е вече възможно, но финансово означава обществото да отдели огромни средства за изработването на такива паспорти. В Холандия например пациентите са паспортизирани по отношение на лекарстваметаболизиращите ензими. На тази база всеки личен лекар да може да отвори съответната информация и да избере кое лекарство е подходящо или неподходящо за пациента и каква да е стартовата доза при терапия. Така че технологичните възможности са налице или са силно напреднали, ако не покриват изцяло понятието за такъв биохимичен паспорт.
Масспектрометрията е един от основните методи, който ще реши този въпрос, защото биохимичният паспорт означава да изследваме целия коктейл от малки, средно големи и големи молекули. Технологията на функциониране на всяко живо същество е много интересна. Ние имаме 20-23000 гена, но два пъти и половина повече транскрипти. Тоест, преносът на информацията вече се удвоява с 2,5 пъти, отколкото е заложено в нашата генетична информация. След това, от тези 50-60 хиляди транскрипта (приносителите на генетичната информация), ние имаме синтез на 500 000 до 1 000 000 белтъци, които реализират на практика заложената ни генетично функция.
Това е така, защото има много промени, които настъпват след синтезирането на полипептидната молекула – така наречените постсинтетични модификации, променящи много от свойствата и създаващи цялото това белтъчно разнообразие. Човешкият геном вече е описан, горе-долу знаем каква е азбуката или знаем нотите, но сме далеч от написването на „Деветата симфония” – изследванията тепърва се задълбочават и тази област на биохимичен анализ се означава като геномика.
Знаем и колко много са белтъците, а масспектрометрията може да осигури средства за изследването им, които да бъдат полезни за клинично паспортизиране – тази област на биохимичен анализ се означава като пептидомика и протеомика. Малките молекули са около 5-10 милиона повече и при изследването им отново масспектрометрията ще бъде ключово средство.
- Какво е необходимо за изготвянето на биохимичен паспорт?
- Биохимичен паспорт без система от анализ на нуклеинови киселини и без масспектрометрия в областта на протеомиката, пептидомиката и метаболомиката, няма как да има. Аз споменавам три „омикови” науки, но ако трябва да ги изредим, те ще станат 300. Говорим за „омикс” и целта е да разберем смисъла им, за да не стане „комикс“.
Въпросът със създаването на биохимичен паспорт е сериозен и възможен, но изисква технология, изкуствен интелект, самообучаващи се аналитични софтуерни системи за справяне с интерпретацията на натрупаната сложна информация. Говорим за хиляди, понякога за стотици хиляди компоненти, които влизат в системата на изследване.
Това засега не можем да си го представим, защото една уважаваща себе си лаборатория има до 1000 показателя в обичайния си репертоар. Всеки от тях се изследва поотделно. Масспектрометрията е високо технологична, изискваща инвестиции за апаратура, специална подготовка и висока експертиза на персонала, което ограничава нейното масово приложение.
Но вече има прототипи на масспектрометрични апарати, изглеждащи и опериращи като стандартен клинично-химичен анализатор. И колкото е „лесно“ да изследваме хормони с имунохимични методи, почти толкова лесно ще стане да ги изследваме и с масспектрометрия. И тя ще се превърне в един стандартен автоматичен инструмент в рутинната клинична лаборатория.
Милена ВАСИЛЕВА
